为建立高效液相色谱法(HPLC)测定马香苓口服液白术内酯Ⅲ含量的马香方法,用色谱柱为ZORBAX SB-C18,苓口立以水和甲醇为流动相梯度洗脱,服液方法流速0.8 mL/min,中白酯Ⅲ柱温25℃,术内检测波长223 nm,含量进样量30μL。测定结果显示,马香白术内酯Ⅲ检测质量浓度在0.57μg/mL~73.00μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的苓口立线性关系(y=1.356 7x+0.857 6,R2=0.992,服液方法n=6),中白酯Ⅲ精密度、术内重复性、含量稳定性试验的测定平均相对标准偏差(RSD)分别为2.00%、8.58%和6.00%;加样平均回收率为98.04%,马香RSD=11.89%,回收率良好。该方法准确稳定,简便可行,能够很好的控制马香苓口服液白术内酯Ⅲ的含量,也为该制剂质量控制提供了一种有效的方法。
马香苓口服液是由广藿香、白术、马齿苋等制成的纯中药口服液,临床主要用于治疗病毒引起的仔猪腹泻。研究表明,该制剂工艺稳定可行,无刺激性,治疗仔猪腹泻总有效率达96%,治愈率达90%。为进一步控制该制剂的质量,便于临床药效学研究,故对该方剂做其定量的方法研究。白术具有健脾益气,燥湿利水,止汗,安胎之功效;用于脾虚食少,腹胀泄泻,痰饮眩悸,水肿,自汗,胎动不安。在马香苓口服液中作为臣药,它的主要成分作用为白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮等,该类成分具有调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的作用,也是控制白术药材质量的主要指标之一。据报道,其白术内酯Ⅲ含量可以作为评定中药散剂、口服液水提工艺等指标。因此,采用高效液相色谱法(HPLC)测定本制剂中白术内酯Ⅲ的含量并做方法学研究,可以为该制剂的质量标准提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与试剂
白术内酯Ⅲ(含量99.9%,20 mg, 批号:11978-201501),中国食品药品检定研究院产品;马香苓口服液,中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制(批号20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721);甲醇(色谱纯,规格1 L,批号20161006),天津川普伟业科技有限公司产品;水为超纯水,石油醚(60℃~90℃,批号20160901)烟台市双双化工有限公司产品;其余有机试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
DIONEX UItiMate 3000高效液相色谱仪,美国赛默飞世尔科技公司产品;NewClassic MS 电子天平,梅特勒-托利多上海有限公司产品;Milli-Q型超纯水机,美国Millipore公司产品;KQ 3200DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司产品。
1.1.3 色谱条件
色谱柱:ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm, 美国Agilent Technologies),以水和甲醇为流动相梯度洗脱(表1),流速0.8 mL/min, 柱温25℃,检测波长223 nm, 进样量30 μL。
1.2 方法
溶液制备:以甲醇和500 mL/L甲醇水溶液为空白溶液。精密称取白术内酯Ⅲ1.46 mg, 置2 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,密封,摇匀,即得浓度为0.73 mg/mL的对照品储备液。精密移取白术内酯Ⅲ标准储备液1 mL,置10 mL棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,制成浓度为0.073 mg/mL,作为白术内酯Ⅲ对照溶液。量取中药口服液25 mL于125 mL分液漏斗,加石油醚(60℃~90℃)振摇提取4次,每次40 mL,收集上层石油醚有机溶液,水浴挥干(水浴锅温度90℃),残渣加500 mL/L甲醇水溶液使其溶解,并定容至10 mL容量瓶,即得供试品溶液。取按处方比例并以同样制备工艺的缺白术的阴性对照口服液,按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。
2 结果
2.1 专属性试验
取空白、对照品、供试品和阴性对照溶液,过0.22 μm有机微孔滤头于1 mL进样瓶中,密封,参照文献并按色谱条件自动进样测定,每个样品进样2次,记录色谱图(图1),结果白术内酯Ⅲ对照品溶液理论板数为13327;在与白术内酯Ⅲ对照品溶液色谱峰对应的位置上,供试品(26.063 min)与其对照品(26.419 min)保留时间一致,其理论塔板数为21420,且与其他组分分离度大于1.5;阴性对照溶液在对照品与供试液相应的保留时间内未检出色谱峰,表明样品中其他成分不干扰白术内酯Ⅲ的测定。
2.2 线性关系考察
精密量取白术内酯Ⅲ对照液1 mL于2 mL容量瓶,加色谱甲醇定容至刻度,依次进行倍比稀释得系列标准溶液,其浓度分别为73.00、36.50、18.25、9.13、4.56、2.28μg/mL,按色谱条件自动进样上述系列溶液各30 μL,每个浓度进样2次,记录色谱图并测定峰面积。以白术内酯Ⅲ峰面积(y)纵坐标,检测质量浓度(x,μg/mL)为横坐标进行线性回归(图2),得回归方程y=1.356 7x+0.857 6,R2=0.992,结果表明,白术内酯Ⅲ检测质量浓度在0.57 μg/mL~73.00 μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.3 精密度试验
精密量取对照品溶液,按色谱条件自动进样30 μL,连续进针6次,记录色谱图,测定峰面积。计算结果保留时间RSD=3.04%,相对峰面积RSD=2.00%,表明仪器精密度良好。
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